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胞壁酰二肽对儿童急性白血病骨髓树突状细胞体外扩增的影响

点击数:28732012-02-28 15:48:33 来源: 武汉楷伦

新闻摘要: 胞壁酰二肽产品信息 白血病微小残留病灶( m inim a l residua l d isease, MRD )的存在, 是疾病复发、治疗失败的主要原因。 清除MRD 日益引起人们的重视, 成为继化疗、骨髓 移植( bone m arrow transplantation, BMT )后的治疗 白血病的一种新方法。树突状细胞( dendritic cells, DC )是免疫系统功能最强的专职抗原呈递细胞 ( APC ) , 惟一能够致敏初始型T 细胞 , 在体内外 均可以诱导特

    胞壁酰二肽产品信息  

     白血病微小残留病灶( m inim a l residua l d isease, MRD )的存在, 是疾病复发、治疗失败的主要原因。 清除MRD 日益引起人们的重视, 成为继化疗、骨髓 移植( bone m arrow transplantation, BMT )后的治疗 白血病的一种新方法。树突状细胞( dendritic cells, DC )是免疫系统功能最强的专职抗原呈递细胞 ( APC ) , 惟一能够致敏初始型T 细胞 , 在体内外 均可以诱导特异性细胞毒性T 淋巴细胞( CTL )的 生成, 从而发挥杀瘤作用。胞壁酰二肽( N -乙酰胞 壁酰-L-A la-D -isoG ln, 即壁氨酰-L-丙氨酰-D-谷氨 酰胺, M uram y lD ipep tide, 简称MDP)是福氏完全佐 剂中具有免疫增强活性的分枝杆菌细胞壁的最小有 效成分, 具有高活性、低毒性的特点, 对肿瘤及病原 微生物具有免疫刺激及免疫治疗作用。本研究 采用急性白血病儿童骨髓单个核细胞(MNC )作为 诱生DC 的来源, 观察MD P对DC 体外扩增及成熟 方面的影响。 

材料和方法
       骨髓来源 骨髓采集自本院小儿血液科8例急性淋巴细胞性白 血病患儿, 其诊断和疗效评定均按照血液病诊断及 疗效标准 。8例患儿均顺利完成化疗并获完全缓 解达6个月以上, 无复发及其它并发症。住院当日 采集骨髓3- 5m ,l肝素( 20 U /m l)抗凝。 
     主要仪器和试剂 胞壁酰二肽( MD P)为S igm a公司产品; 胎牛血清 ( FCS)为杭州四季青公司产品; 重组人粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子( rhGM -C SF)、重组人白细胞介 素-4( rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子--( TNF--) 为 Pepro tech A sia 公司产品; FITC an ti-hum an CD 1a、 HLA -DR、CD 83 为B ioL egend 公司产品; FACS C alibur流式细胞仪为美国Becton D ickinson公司产 品; 二氧化碳培养箱为INCO2 m emmert型。
骨髓MNC的分离 无菌采取抗凝骨髓3- 5 m ,l 用Fico ll-paque 法分离 MNC, 400 μ g 离心10分钟, 洗涤3次, 调整细胞浓 度为1 μ 106 /m ,l 接种于24孔培养板, 于37? , 5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养3- 4小时。
骨髓DC的诱导 实验分为4 组。对照组: 10% FCS RPM I 1640 + MNC; 实验1组: MNC + MDP ( 102μg /L ); 实验2 组: MNC + rhGM -C SF ( 100 ng /m l) + IL-4 ( 100 ng / m l) + rhTNF-- ( 20 ng /m l) ; 实验3 组: MNC + rhGM -C SF ( 100 ng /m l ) + IL-4 ( 100 ng /m l) + rhTNF-( 20 ng /m l) + MDP ( 102 μg /L )。各组细胞 均在37℃ , 5% CO2、饱和湿度孵箱中培养, 隔天半 量换液及全量补充细胞因子与MDP。
DC的光学显微镜观察 在DC 培养过程中, 倒置显微镜下每日观察细胞生 长情况及形态变化。
     DC计数和免疫表型测定 收集第8天的DC, 进行计数。调整细胞浓度至少 为1 μ106 /m l后分入4组试管, 每管100μ,l 分别加 入抗HLA -DR、抗CD1a、抗CD 83 及阴性对照 ( FITC 荧光标记的鼠抗人IgG1)各20μ,l 4℃ 避光 静置30分钟, 离心洗涤2次, 1% 多聚甲醛固定, 流 式细胞术分析荧光强度。本步实验重复3批次。 
     统计学处理 应用SPSS 17. 0统计学软件进行数据处理, 数据用 均数!标准差(X ! SD )表示, 组间比较采用方差分 析及t检验。
结 果

      DC形态 对照组在培养第3天时细胞大量死亡, 数量明显减 少; 而实验各组在培养第2天细胞体积变大, 变圆, 并聚集成大小不等的丛样集落。第3 - 4天可见单 个核细胞呈豆芽状外观, 少数细胞悬浮, 随后逐渐出 现树枝样突起。第5- 6天部分细胞悬浮, 树枝样突起更加明显。第7- 8天时大部分细胞均悬浮状态, 细胞表面伸出树枝样突起, 形态不规则(图1A - D )。

现象

{#1#}
各组DC计数 培养第8天, 实验1组、2组、3组DC 数明显高于对 照组( t分别为9. 82、12. 35、18. 03, p 均< 0. 01) ; 实 验1组DC 数低于实验2组及3组( t分别为4. 81、 7. 26, p 均< 0. 01) ; 实验3组DC 数明显高于实验2 组( t = 4. 00, p < 0. 01) (表1)。
数据

细胞免疫表型 检测结果表明, 实验1组HLA -DR 细胞比例明显高 于对照组( t= 6. 75, p < 0. 01 ) , 而低于实验2组、3组( t 分别为10. 06、12. 76, p 均< 0. 01) ; 实验3组 明显高于2组( t = 7. 02, p < 0. 01); 实验1组CD1a 细胞比例明显高于对照组( t = 5. 46, p < 0. 01 ) , 而 低于实验2 组、3 组( t 分别为4. 98、8. 66, p 均< 0. 01) ; 实验3组明显高于2组( t= 3. 98, p < 0. 01); 实验1 组CD 83 细胞比例明显高于对照组( t = 6. 51, p < 0. 01) , 而低于实验2组、3组( t 分别为 4. 32、10. 10, p 均< 0. 01); 实验3组明显高于2组 ( t = 6. 68, p < 0. 01) (表2)。

数据


    讨 论 MRD 是白血病容易复发的主要根源, 增强特异性与 非特异性免疫能力清除MRD 是急性白血病治疗的 新途径。 
DC 被认为是免疫系统中最强的APC, 表面高 表达HLA-DR 和共刺激分子CD 80, CD 83, CD 86, CD40, CD 58 及ICAM 1 ( CD54 ) 等。DC 可通过 MHC-?类和+类两条途径呈递抗原肽, 导致CD 4+ 辅助T 细胞和CD 8+ CTL 活化; 释放出T 细胞刺激 因子(主要是IL-12) , 显著诱导T 细胞增殖。DC 的 另一个特点是体内外均可以激活初始T 淋巴细胞。 这些特点使DC 成为一个理想的生物免疫佐剂和抗 原载体[ 4] 。目前体外获取人DC 来源主要包括外周 血、脐血或骨髓的CD 34+ 细胞。
     白血病发病初期体内存在大量荷瘤细胞, 免疫 系统失去免疫监视功能, 目前的免疫疗法均需借助 于化疗将大量瘤细胞杀灭之后才能进行[ 5] , 这是选 择6个月以上完全缓解期患儿的原因。
MDP是分枝杆菌细胞壁骨架中具有免疫佐剂 活性的最小结构单位, 可以代替整体分枝杆菌, 促进 机体对外源性抗原的特异性免疫反应 。MD P还 能在一定程度上增强机体对感染和肿瘤的非特异性 抵抗力, 所以又称之为免疫调节剂( Imm unomo- dulato r) , 其以激活单核-巨噬细胞系统的抗肿瘤作 用被广泛研究。MD P能促进淋巴细胞转化、增殖, 高效地提高IL-1、IL-6、TNF--、INF- 及GSF 等多 种细胞因子的分泌水平[ 6, 7] 。本实验结果显示: 经 光学显微镜及流式细胞仪检查, 实验各组培养的 DC 有明显的树突状突起, 细胞表面高表达CD83, CD 1a及HLA -DR免疫分子表型, 提示诱导出了成 熟的DC。同时, 实验1组CD 83, CD1a及HLA -DR 均高于对照组, 但低于实验2 组、3 组; 实验3 组 CD 83, CD 1a 及HLA -DR 均明显高于2组, 且细胞 数量明显增多。研究结果提示MD P在促进DC 的 增殖方面弱于细胞因子的作用, 但联合应用在数量 和成熟程度上均较单独应用为高, 说明MDP能够 协同细胞因子促进急性白血病骨髓DC 的增殖和成 熟。
     高效低毒的免疫调节剂MD P用于白血病, 尤 其是用于免疫功能低下并发感染的晚期患儿联合化 疗, 将有其独到之处, 但其对DC 增殖及促成熟方面 的作用机制有待于进一步研究。
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