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米替福新对常见皮肤癣菌体外抑菌活性的研究

点击数:33662012-02-28 15:25:50 来源: 武汉楷伦

新闻摘要:近年来真菌感染发生率逐年增加, 尤其是免疫抑制的病人, 临床对高效、敏感的抗真菌药物的需求越来越强。米替福新( MI) 是治疗利什曼原虫的有效药物 。有学者发现其有广的抗真菌作用。为了解MI 对临床常见皮肤癣菌的体外抗真菌活性, 笔者参照美国临床和实验室标准化研究所( CLSI) 的抗真菌药物体外敏感性试验方案, 测定了MI 对77 株皮肤癣菌的抑菌作用。现报道如下。

      米替福新

      近年来真菌感染发生率逐年增加, 尤其是免疫抑制的病人, 临床对高效、敏感的抗真菌药物的需求越来越强。米替福新( MI) 是治疗利什曼原虫的有效药物 。有学者发现其有广的抗真菌作用。为了解MI 对临床常见皮肤癣菌的体外抗真菌活性, 笔者参照美国临床和实验室标准化研究所( CLSI) 的抗真菌药物体外敏感性试验方案, 测定了MI 对77 株皮肤癣菌的抑菌作用。现报道如下。

材料与方法
一、材料 MI 用RPMI 1640 溶解, 储存液128μg/ ml; 伊曲康唑( IT C) 用二甲基亚砜溶解, 储存液1 600 μg/ ml; 特比萘芬( T RB) 和布替萘芬( BT F) 用95% 二甲基亚砜与5% 吐温80 溶解, 储存液1 600 μ g/ ml。试验用菌株: 临床株74 株( 含三属即毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属) , 其中红色毛癣菌19 株, 须癣毛癣菌17 株, 断发毛癣菌15 株, 苏丹毛癣菌3 株, 紫色毛癣菌3 株, 絮状表皮癣菌5株, 犬小孢子菌5 株, 石膏小孢子菌5 株及库柯小孢子菌2 株。以上菌种均系澳大利亚悉尼大学附属Westmead 医院微生物感染性疾病研究中心保藏菌株, 均经过形态学鉴定。标准株3 株: 红色毛癣菌ATCC28188, 须癣毛癣菌ATCC28185, 断发毛癣菌ATCC28942。实验室质控株的选择: 以近平滑念珠菌AT CC22019 和克柔念珠菌AT CC6258 作为质控株。
二、方法 皮肤癣菌和念珠菌的测定分别参照CLSI 制定的M38-A 和M27-A2 方案进行。培养基为RPMI 1640 液体培养基, 以终浓度为0. 165 mo l/ L的MOPS 为缓冲液, 调整培养基在25 ℃ 时值为7. 1± 0. 1。抗真菌药物的最终工作浓度: MI 为64 ~ 0. 125 μ g / ml, ITC 为16 ~0. 031 μ g/ ml, T RB 和BTF 均为2~ 0. 0039 μ g / ml。皮肤癣菌参照M 38μ A 的修改方案 , 用生理盐水稀释, 调成0. 9~ 1. 1麦氏浊度的菌悬液; 再将此菌悬液用RPMI 1640 1:50 稀释, 接种终浓度约为( 0. 3~ 6. 4) × 104 CFU / ml。对所有红色毛癣菌同时采用在调成0. 9~ 1. 1麦氏浊度的菌悬液前, 让其通过孔径8 μ m 的滤纸( 仅含小分生孢子) , 再按上述方法操作。质量控制按照M 27μ A2 方案, 用ITC 对近平滑念珠菌AT TC 22019 和克柔念珠菌A TCC6258 进行反复测定。每次试验只有当其最低抑菌浓度( MIC) 值介于其质控范围之内才认为实验操作准确可靠, 且只有当生长对照孔生长良好、其它孔有随药物浓度升高则生长梯度受抑制时证明试验成功。将接种后的药敏板于28 ℃ 条件下孵育, 皮肤癣菌在第7 天生长对照孔生长良好时读取结果。MIC值为肉眼直接观察到的无真菌生长的最低药物浓度; 对于ITC, MIC 值为真菌生长80% 受抑制孔中的最低药物浓度; 对于MI、T RB、BTF, MIC 值是肉眼直接观察到的无真菌生长的最低药物浓度。
 三、统计学处理 不同属的MIC 的几何均数应用SPSS14. 0 软件, 采用秩和检验对资料进行分析。{#1#}
结 果

MI、I T C、T RB、BT F 四种药物对77 株皮肤癣菌的MIC 测定结果见表1。MI 对所有受试的皮肤癣菌均有较好的抑菌作用。MI 的MIC 的几何均数极显著低于IT C( P< 0. 01) , MI 的MIC50 和MIC90比ITC 均低4 倍, 并且MI 的MIC 的范围窄。另外, IT C 对15 株皮肤癣菌的MIC 大于4. 0μg/ ml。IT C 对表皮癣菌属、毛癣菌属和小孢子菌属的MIC的几何均数分别为0. 226、1. 993和2. 663μg/ ml( 表皮癣菌属分别与毛癣菌属和小孢子菌属比较, 均P< 0. 01) 。四种药物对19 株红色毛癣菌通过滤纸和不通过滤纸所制备的菌悬液MIC 测定结果见表2,它们的MIC 值差别在一个稀释度内。

数据

 

讨 论
    由于广谱抗生素、放疗、化疗的广泛应用, 深、浅部真菌病的发病率逐年增多, 使真菌病的治疗面临着严峻的挑战。甲真菌病是临床常见的发生在手足指( 趾) 甲的慢性易复发的真菌感染, 其病原菌最常见的是皮肤癣菌, 也可由酵母菌和其它真菌引起 。同时抗真菌治疗领域中, 如更加有效的三唑类药物IT C 和丙烯胺类TRB 的相继问世, 既提高了疗效又缩短了疗程。然而有IT C 和TRB 耐药、临床治疗失败的报道 。因此, 寻找新的高效、敏感的抗真菌药物显得尤其重要。通过本试验, 首先证实了MI 对临床重要的皮肤癣菌有很强的抗真菌活性。在本试验中, 大约有20%的IT C 的MIC 大于4. 0μg/ ml, 可能是临床治疗失败和/ 或复发的原因。相反, MI 在感染的老鼠模型其血药浓度可高达44. 8 μg/ ml , 在MI 治疗利什曼病时, 病人的血药浓度可超过20μg / ml,远高于本试验中MI 的MIC90 ( 1μg/ ml) 。IT C 对皮肤癣菌的三属的MIC 几何均数有明显差异的原因不清楚, 有待进一步的研究, 但对于临床选择用药有一定的指导意义。本试验中TRB 和BTF 显示很好的抗皮肤癣菌活性, 与其它研究一致 , 但BTF 仅用于局部, 没有系统用药治疗甲真菌病。
    对皮肤癣菌体外抑菌活性的研究, 其孵育的温度和时间没有完全统一。本试验选择在28 ℃ 条件下孵育有清晰的终点判定。关于孵育的时间, 笔者发现孵育7 天试验有很好重复性, 而4 天对一些毛癣菌属其生长不够充分。磷脂酶是很多致病真菌的致病因子 , 皮肤癣菌能产生脂肪酶, MI 对皮肤癣菌有很强的抗真菌活性有可能作用于此。综上, MI 对常见皮肤癣菌有很好的抑菌活性,其具体的机制有待进一步研究。虽然本实验提示SLE 的发病可能与骨髓细胞的凋亡异常有关, 但有必要进一步进行探讨。首先,本实验只是初步了解BXSB 狼疮鼠骨髓细胞凋亡的情况。在未来的实验中, 可通过小鼠造血干细胞表面的特殊标志物, 利用流式细胞技术对骨髓细胞进行进一步提纯, 然后检测造血干细胞的凋亡情况。其次, 动物模型不同于人类。实验表明SLE 动物模型是自发诱导的, 与基因密切相连, 异常通常存在于造血干细胞, 可以通过异体BMT 缓解和治愈。但基因和环境因素对狼疮发展的影响在高度近交的小鼠品系和高度多形的人类是完全不同的。单卵双生子研究提示只有1/ 3 双生子同时发病, 可见非基因因素也起着重要作用, 即SLE 的基因外显率在人类是不完全的。Papadaki 等用流式细胞技术和体外细胞培养的方法对7 名SLE 患者的骨髓细胞进行实验, 结果发现, 与对照组相比, SLE 患者的骨髓细胞中CD 34+ 细胞明显下降, 而且CD 34+ / Fas+细胞明显增加。这些结果提示Fas 调节的细胞凋亡的增加可能是SLE 患者的骨髓细胞中CD 34+ 细胞( 造血干细胞) 明显下降的发生机制之一。临床上,SLE 患者常有血液系统的"三系"减少, CFU-GM 集落形成有减少的倾向, 这些都与狼疮鼠模型不大相同。因此有必要对SLE 患者的造血干细胞进行进一步的研究, 以探讨其是否存在异常及其在SLE发病中所起到的作用。
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